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峰形不好怎么办?-方法开发之峰形优化

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公司新闻
2019/06/25 09:42
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【摘要】:
我总会想象三乙胺抱着硅羟基,带着胜利的微笑看着碱性分子失落走开的样子。哈哈哈。

由于本文干货较多,信息量也比较大,建议大家先收藏,有时间可以多看两遍。正文涉及到理论的部分我会尽量多配几张图,以便大家理解。本文主要介绍方法开发过程可以改善峰形的办法。如果觉得本文还不错,请点赞鼓励下小编哦。别忘了在朋友圈分享,和大家一起学习吧~~~

 

峰形对称性的优劣对于峰形和分离度有很大的影响,从而影响分析结果的准确性。然而影响峰形异常的因素很多,各种形式的污染,系统中的死体积,以及色谱柱填料塌陷都有可能对峰形产生影响。先简述下导致峰形异常可能存在的系统因素有:

 

1.污染。色谱柱柱头筛板堵塞污染,重金属污染,大极性样品残留导致污染,溶剂滤头,过滤滤芯或者保护柱的污染,都有可能影响峰形。有时候也会出现检测器流通池污染影响基线导致峰形异常的情况。

2.死体积。各种接头处由于连接不当或者接头不匹配产生的死体积;管路过长或者内径过大产生的死体积。

3.样品超载。进样体积过大或者样品浓度过高,容易产生峰前沿,拖尾或者平头峰的情况。

4.色谱柱。填料流失或者塌陷

 

 


本文针对在系统正常的情况下,单纯从方法开发的角度,探讨液相方法和峰形之间的关系。我们以最常见的反相系统为例,流动相是常见的甲醇/乙腈/水组合,色谱柱是普通C18色谱柱,针对该种体系通过调整液相方法来改善峰形拖尾的问题。由于原理比较抽象,所以文章前半部分讲优化的方法,后半部分再说这样做的原理。

 

峰拖尾分两种:前延和后延。即主峰前拖尾和后拖尾两种情况。

 

 

第一种情况 主峰前沿

 

 

 

图1 前延峰

 

 

 

过载 

 

 首先要检查样品是否过载。

降低进样浓度,看峰形是否有所改善,一般认为峰高在100mAU左右比较合适。

 

 溶剂

 

然后检查是否用流动相溶解的样品

也就是说,溶剂最好用流动相进行溶解。如果使用的是梯度方法,一般选择用初始比例的流动相作为溶剂溶解样品。这样做是为了防止产生溶剂效应。因为当溶解样品的溶剂极性大于流动相的极性时,由于大极性的溶剂分子与小极性C18长链之间作用力小,从而能够带着部分样品更快的洗脱出来,这样就产生了前沿峰。

 

 

缓冲盐

 

增加流动相中缓冲盐的浓度

增加缓冲盐浓度,可以增加流动相中离子强度,减小因静电力作用引起的前沿。

 

四氢呋喃

 

流动相中加入适量的四氢呋喃

有时在流动相中加入适量的四氢呋喃有利于改善峰形,增大分离度,一般加入的量小于5%。

 

柱温

 

升高柱温

升温有利于改善峰形,但是温度不宜太高,尤其是使用离子对试剂的时候,否则会对色谱柱造成损伤。柱温最好不要超过四十度。需要注意的是,当柱温比较高的时候,如要关机,需要先降低柱温至室温,再停止流速;不可以直接停止流速就关机。

 

这个问题我在另一篇文章中也提到过,不过那个文章还没有发出来,想看的朋友可以关注北京雷台仪器公众号,我会在以后发布。

 

 

第二种情况,主峰拖尾。

 

 

 

 

图2 拖尾峰

 

 

 

同样需要检查样品是否过载

 

样品过载通常会引起峰形变差,如果峰很高甚至超过2000mAU,且峰前后拖尾,通常认为有过载现象。但这一点并不绝对,因为不同化合物吸收强度和仪器型号不尽相同,所以样品是否过载要结合峰形,进样浓度,进样体积以及仪器型号一起判断。

 

 

在流动相中加酸

 

在流动相中加酸调节PH小于2.5有利于改善分子结构中含有羧基的化合物的峰形。因为酸性环境能够抑制硅羟基和有机酸的离子化。

 

添加缓冲盐或者增大其浓度

 

缓冲盐能够增大流动相中的离子强度,干扰离子的存在有利于削弱样品分子与硅羟基之间的接触机会,从而削弱其相互作用,进而改善峰形

 

 

在流动相中加入三乙胺


 

流动相中加入三乙胺有利于改善碱性化合物的峰形。因为在平衡色谱柱的过程中,三乙胺能够优先与色谱柱中的硅羟基结合,从而占据有利地形,使碱性样品分子“无从得手”“错失良机”。三乙胺就这样C位出道,傲视群雄,得意洋洋的改善了峰形。

 

我总会想象三乙胺抱着硅羟基,带着胜利的微笑看着碱性分子失落走开的样子。哈哈哈。通常情况下,加入2%的三乙胺就会有显著的效果,有时候可能需要适当增大用量。需要注意的是:

 

a三乙胺碱性很强,注意不要超出色谱柱的耐受范围;同时加入三乙胺有可能会导致出峰时间的变化,通常在加入三乙胺之后需要回调PH值,即便如此,保留时间依然可能发生变化;

b此外,三乙胺在210nm处有较强的吸收,如检测方法的波长是在此波长附近,需谨慎考虑使用,否则可能因本底升高引发灵敏度严重降低的现象;

c当然,如果液相后边还连接有质谱的话,不建议使用三乙胺以及他的好兄弟三氟乙酸,这两个家伙会抑制离子化同时不容易清除,污染质谱系统,降低其他离子对的灵敏度。

 

 

原理

 

 

 

以上是一些常见的改善峰形的优化方法。接下来掰扯下相关的原理。也是蛮有趣的。

 

 

主角是文中反复出现的硅羟基


 

众做周知,c18色谱柱填料本应该是C18 长链基团嘛,那硅羟基这个家伙为什么会存在于色谱柱中呢?

 

 

 

 

图3    C18 愤怒的看着硅羟基,硅羟基眼泪汪汪

 

原来,C18填料合成过程是C18的氯硅烷与硅胶表面的硅羟基反应,从而将C18长链键合在硅胶表面。然而,由于空间位阻的作用,只有约50%的硅羟基能够与C18长链结合,剩余的硅羟基还都自由而快乐的蜷缩在巨大的C18长链的夹缝中。由于硅羟基容易与样品分子产生次级保留效应引起拖尾,所以需要将游离状态的硅羟基反应或者屏蔽,处理掉这些“万恶之源”。通常的办法使用小分子硅烷与硅羟基反应,例如三甲基硅烷。

 

图4 C18填料合成原理

 

 

但是不管怎么说,三甲基硅烷还是比氢原子大得多,同样由于空间位阻的作用,三甲基硅烷也不能将所有的氢原子取代依然会有残存的硅羟基存在。硅羟基就是这么被存留下来的。

写到这里,怎么脑子里回想起《离歌》的旋律了……“想留不能留,才最寂寞~没说完温柔,只剩离歌~~~”

言归正传,相同的样品在不同色谱柱之上的拖尾不同,也就是由于接触硅羟基数量不同导致的。从填料合成的角度就是键合方式是否紧密,封尾是否彻底,紧密的键合和彻底峰封尾能够有效改善峰形。北京雷台仪器公司主要经营二手分析仪器的销售,维修以及实验室耗材物料的销售业务,其中就有不同规格的色谱柱。欢迎大家购买使用。

 

 

那么上述加酸加碱加缓冲盐改善峰形又是什么原理呢?

 

 

原来,样品之所以愿意与硅羟基结合是有原因的。

C18长链是非极性的,与样品分子之间的作用力只有微弱的范德华力。而硅羟基具有一定极性,与极性分子之间的力是一种静电作用力,这种作用力比范德华力强得多。由于硅胶表面有很多横七竖八的C18挡着,能够有机会和样品分子结合的机会也不是很多,少部分“幸运”的样品分子与残存的硅羟基产生作用(那个,又想到《千与千寻》里锅炉爷爷说:这是爱情的力量啊,哈哈,搞笑)。大部分样品分子均匀前移,少部分“转角遇到爱”的样品分子与硅羟基依依惜别,推迟被洗脱出来,从而导致拖尾。因此,拖尾的程度与硅羟基残余量和样品分子极性大小有关。所以前文提到,极性大的化合物容易产生拖尾。

那么加酸加碱加缓冲盐的意义就在于此了,它们可以抑制硅羟基或者样品分子离子化,或者抢先占据位点,从而减少样品分子与残存游离硅羟基的接触机会,进而改善峰形了。



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终于写完了,好累。其实还有一些关于PKa的知识点

想了解这面知识点的同学在下方留言,想看我再写

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